常规高压氧对新生小鼠视网膜影响的研究

曹 春 妮     肖平田

中南大学湘雅医院高压氧科（长沙410008）

摘要   目的：观察常规高压氧和持续常压高浓度氧对新生小鼠视网膜的影响。方法：比较常规高压氧与常压高浓度氧下的新生小鼠突破视网膜内介膜血管内皮细胞核数；视网膜血管的分布情况；网膜神经节细胞层VEGF的表达水平；血浆中SOD、MDA的含量。结果：常规高压氧未诱发未成熟视网膜新生血管的形成，突破视网膜内介膜血管内皮细胞核数无显著性增高，VEGF的表达水平、SOD和MDA的含量无显著性差异。常压持续高氧组突破视网膜内介膜血管内皮细胞核数目明显增加，视网膜神经节细胞层VEGF的表达明显增高，血浆中MDA含量明显增加。结论：常规的高压氧处理不影响新生小鼠视网膜血管的正常生长发育，不诱发视网膜新生血管的形成，也不影响视网膜神经节细胞层VEGF的表达及小鼠血浆中SOD、MDA的含量；而持续的常压高浓度氧影响新生小鼠视网膜血管的正常生长，可诱发与ROP发生密切相关的视网膜新生血管形成，其影响可能与抑制VEGF的表达，降低SOD的生成，增加了MDA的生成相关。

关键词  高压氧，常压高浓度氧，视网膜新生血管，血管内皮生长因子,超氧化物歧化酶,丙二醛

早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, ROP）旧称为晶状体后纤维增生症，是未成熟儿尤其是低体重出生儿所发生的一种视网膜毛细血管发育异常的双侧性眼病，其特征为视网膜缺血、新生血管形成，以及增殖性视网膜病变，重症者可以引起视网膜脱离而导致永久性失明。目前，全世界该病已成为儿童致盲的重要原因，约占儿童致盲原因的6％～18％^[1]。随着医疗技术水平及新生儿重症监护的建立，早产儿存活率增高ROP的发生率也呈上升趋势，每年全世界有50,000个儿童因为ROP导致双目失明^[2]。

高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）治疗它已经广泛地应用于临床，对治疗新生儿缺血缺氧性疾病，如缺血缺氧性脑病、癫痫、脑瘫均取得了较好的疗效^[2]。但早产儿缺血缺氧性疾病仍然是高压氧治疗的盲点，主要受早年普遍认为早产儿应用高压氧治疗会导致晶状体后纤维化的影响。John和Torbati进行了高压氧对未成熟视网膜影响的研究，两位得出了完全相反得结论，John认为高压氧处理不会对未发育成熟的视网膜造成影响，而Torbati认为高压氧会诱发视网膜新生血管的生成。

近年来临床研究及实验研究均认为吸氧是ROP发生的主要影响因素^[3]，而临床医生混淆高压氧与常压高浓度氧的概念，过分夸大高压氧的毒副作用。临床上常规的高压氧治疗是否可以应用于早产儿一直存在很大的争议，国内外对ROP发生的机制的研究较为深入，但对于高压氧处理对未成熟视网膜影响及其影响机制的研究国外有极少的报道，而国内尚无报道。本研究通过对新生小鼠进行高压氧和持续常压高浓度氧处理，并设立空气对照组，再观察处理后视网膜新生血管的生成情况、视网膜VEGF的表达和血浆中SOD、MDA含量的改变，了解常规的高压氧和持续的常压高浓度氧对未成熟视网膜的影响以及可能的机制。   

 1．材料与方法

选用C57BL/6新生小鼠随机分为常压高浓度氧组（A组）、高压氧处理组（B组）、常压高浓度氧＋高压氧处理组（C组）和空气处理对照组(D组）。其中高压氧处理压力分别为0.15MPa（B1组）、0.18MPa(B2组)、0.20MPa(B3组)。每组小鼠20只，共120只。

主要试剂：小鼠VEGF单克隆抗体（Santacruz公司产品），SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），MAD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。主要仪器设备：YLCO.5/1A型婴儿氧舱（武汉船舶七0一研究所制造）

高压氧与常压高浓度氧的处理：不同治疗压力的高压氧处理：将7日龄的新生小鼠连同母鼠置于YLCO/1A型婴儿氧舱内，先以10L/min的氧流量进行门缝洗舱3min，提高舱内氧浓度至55％以上，然后以5～8L/min氧流量均匀变速加压，加压时间为12min，使舱内压力达到0.15MPa时开始稳压，稳压时氧浓度达到85％以上，稳压时同时打开加、减压阀，以3～5L/min的氧流量持续小流量换气，稳压吸氧40min后，均匀变速减压，减压时间为15min^[9]。总治疗时间为70min，2次/天（2次治疗中的间隔时间＞4小时），连续治疗十次为一个疗程，5天后再将新生小鼠放于空气中饲养5天。不同治疗压力组，分别将稳压压力维持在0.18MPa、0.20MPa，余加减压及稳压时间、方法、治疗疗程、疗次均同上。

常压高浓度氧处理组：将7日龄的新生小鼠连同母鼠置于YLCO/1A型婴儿氧舱内（在饲养箱内铺上木屑石灰等垫料，以便吸除小鼠产生的水蒸气及保持舱内干燥），以10L/min的氧流量进行门缝洗舱，将舱内氧浓度达到48％时关闭进氧阀，氧浓度渐上升至65％左右，调节进氧流量在0.6～0.8L/min极小流量换气，观察测氧仪的显示值，将舱内氧浓度控制在（65±3）％，约6～8小时调整一次舱内的氧浓度。1～2天替换一次母鼠。依此连续处理5天后同样放入空气中饲养5天。

常压高浓度氧＋高压氧处理组：以高浓度氧处理方法处理后的小鼠再予以0.20MPa治疗压力的高压氧按高压氧处理方法继续予以处理5天后放于空气中饲养。

取材切片制作、染色及结果观察：将上述出生后第12天和第17天经各组处理的小鼠10只。以10％的水合氯醛（0.03ml/10g）腹腔注射麻醉，剪开眼内外眦，即可摘出眼球，矢状面平行视神经石蜡切片。第17天的各组小鼠随机取100张切片进行HE染色；而第12天和第17天的各组小鼠的每只眼球均随机取5张切片行 VEGF免疫组织学检查。

在光学显微镜下观察视网膜组织形态结构的变化，同时计数突破视网膜内介膜的内皮细胞核数目，分别计数各组小鼠每张HE染色切片上突破视网膜内介膜的内皮细胞核数目，显微镜下摄影记录。

从A组、B各组、C组及D组12天和17天小鼠中每只眼球随机抽取5张未经染色的石蜡组织切片，用链亲合素（streptavidin,SP）法进行VEGF免疫组化检测，观察各组小鼠视网膜神经节细胞层VEGF的表达。显微镜下观察视网膜神经节细胞层VEGF的表达并以摄影记录。

取出第17天A组、B各组、C组及D组的小鼠各10只进行墨汁灌注视网膜铺片，在显微镜下观察视网膜血管的生长分布情况，并用在显微镜下摄影记录。

   在摘取12天及17天的各组小鼠眼球的同时通过眼眶后眼静脉丛采血，约0.1～0.2ml，注入冰盒内EP管中，每组采取10个标本，标本采集完后，用低温离心机以3000转/分离心10min，取血浆密封保存于－70℃低温保存箱内集中进行SOD和MDA测定。

统计分析：所以数据均用统计软件SPSS11.0处理。计量资料采用均数±标准差（x
±s）表示，以a=0.05为检验标准。对多组计量资料进行单因素方差分析，方差齐者采用LSD检验进行均数间多重比较，而方差不齐者采用Tamhane’s T2法进行分析。VEGF在视网膜神经节细胞层的表达用等级资料表示，并采用等级资料秩和检验进行统计学分析。

2．结果

镜下可见，第17天的B各组(图2)和D组(图4)各100张切片中小鼠视网膜的内介膜完整，切片中未发现或只有少数突破内介膜的内皮细胞核，平均每张切片不到2个突破内介膜的内皮细胞核，B各组突破视网膜内介膜的内皮细胞核数与D组比较差异均无显著性意义（P>0.05），且视网膜的各层细胞的排列有序；而A组(图1)和C组(图3)视网膜切片中视网膜内介膜完整性被破坏，可以看到有大量的突破内介膜的内皮细胞核，成簇状出现或单个出现，在视网膜内介膜下也可见因增殖而排列紊乱的内皮细胞，并在部分的切面中可见管腔的形成，且管腔内有红细胞存在，神经节细胞层的细胞排列非常紊乱而无序， A组、C组平均每张切片上突破内介膜的内皮细胞核分别有35个(34.50±17.72)、33个（32.67±14.23），与B各组及D组比较均有显著性差异（P<0.01）,虽A组突破内介膜的内皮细胞核数较C组稍多，但两者比较差异无显著性意义（P>0.05）。详见表1及图5。

表1  第17天各组平均每张切片中突破视网膜内介膜内皮细胞核计数比较（个/张）

注：⑴ 与D组比较：a P>0.05, b P<0.05；⑵ 与A组比较：c P>0.05；d P<0.05；

⑶ 与B1组比较：e P>0.05，f P<0.05； ⑷与B2组比较：g P>0.05，h P<0.05；⑸与B3

组比较：P<0.05

视网膜铺片的结果：显微镜下观察第17天B各组(图8、9)及D组(图12、13)的视网膜血管由视盘发出血管向四周呈放射状均匀分布，直到视网膜的周边部，有部分血管在周边部还较粗，可以形成沿视网膜边缘行走的弓形血管，全部血管可在不同焦距显微镜下观察到两层血管，浅层血管呈放射状分布，而深层血管呈多边形网格状分布。而第17天A组(图6、7)和C组(图10、11)的浅层视网膜大血管从视盘发出后扩张迂回延伸，周边的血管网结构分布极其紊乱，浅深层血管已失去了正常的放射状及多边形网状结构，且视盘的周围出现无血管灌注区。由于视网膜灌注不充分，A、C组视网膜大血管没能充分的显示，但足以观察到大血管的血管壁。

图1：A组视网膜HE染色（×400）图2：B组视网膜HE染色（×400）图3：C组视网膜HE染色（×400）图4：D组视网膜HE染色（×400）图5：A组视网膜铺片视盘周边血管分布（×100）图6：A组视网膜铺片周边血管分布（×100）图7：B组视网膜铺片视盘周边血管分布（×100）    图8：B组视网膜铺片周边血管的分布（×100）图9：C组视网膜铺片视盘周边血管的分布（×100）图10：D组视网膜铺片周边血管的分布（×100）图11：D组视网膜铺片视盘周边血管的分布（×100）图12：D组视网膜铺片周边血管的分布（×100）图13：第12天A组视网膜神经节细胞层（×400）    图14：第12天B组视网膜神经节细胞层VEGF的表达（×400）图15：第12天D组视网膜神经节细胞层     图16：第17天A组视网膜神经节细胞层VEGF的表达（×400）图17：第17天B组视网膜神经节细胞层VEGF的表达（×400）图18：第17天C组视网膜神经节细胞层VEGF的表达（×400）

视网膜神经节细胞层VEGF的表达：第12天A组小鼠视网膜神经节细胞层VEGF的表达明显减弱，与对照D组及B各组比较差异均有显著性意义(P<0.01)，而B各组间小鼠的VEGF的表达差异无显著性意义(P>0.05)，且与对照组D组比较差异宜无显著性意义(P>0.05)。而第17天A组和C组小鼠视网膜神经节细胞层VEGF的表达明显增强，与对照D组比较差异均有显著性意义(P>0.05)，而C组较A组VEGF的表达有所减弱，且比较有显著性意义(P<0.05)。详见图14～20。

表2　各组不同时间点VEGF在视网膜神经节细胞层的表达情况 

注：⑴ 与D组比较：a P>0.05, b P<0.05；⑵ 与A组比较：c P>0.05；d P<0.05；⑶ 与B1组比较：e P>0.05，f P<0.05； ⑷与B2组比较：g P>0.05，h P<0.05；⑸与B3组比较：i P<0.05。

3.5  小鼠血清中SOD活性、MDA含量的测定结果

第12天的A组小鼠血清中SOD的含量明显降低，MDA含量明显增加，与D

组比较差异均有显著性意义（P＜0.01），而B3组SOD含量、MDA含量均稍增加但与对照组比较差异均无显著性意义（P＜0.01）；第17天的各组小鼠血清中SOD的含量比较差异均无显著性意义（P＞0.01），而A组、C组小鼠血清中MDA的含量均有增加，且较对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），C组较A组MDA含量降低，比较差异有显著性意义（P＜0.01）。详见表3、图21及图22。

表3  小鼠血清中SOD的含量（U/ml）、MDA的含量(nmol/ml)

注：⑴与D组比较：a P>0.05, b P<0.05；⑵与A组比较：c P>0.05, d P<0.05；⑶与B1组比较：e P>0.05, f P<0.05；⑷与B2组比较：g P>0.05, h P<0.05；⑸与B3比较：i P>0.05；⑹ 组组间比较：j P>0.05。

3．讨论

早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity,ROP）旧称晶状体后纤维增生症（RLF）是未成熟儿尤其伴有低体重儿发生的一种视网膜毛细血管发育异常化的双侧性眼病，其特征为视网膜缺血、新生血管形成，以及增生性视网膜病变，重症者可引起视网膜脱离而导致永久性失明^[4]。目前临床上报道的ROP的发生均由于孕26周～孕32周早产儿，出生后即放入恒温箱内，持续予以吸高浓度氧（60％～98%）长达5～22天，一段时间后被发现不同程度地出现晶状体囊伸向后方灰白色混浊的条索状物，从周边部及视乳头中央动静脉有新生血管伸向混浊机化体内，而颞侧视网膜局部或完全脱离^[5~7]。同时大量的动物实验也证实了，持续5天予以高浓度氧处理的小鼠，处理后小鼠的视网膜可见大量新生血管的生成^[7、8]。大家普遍认识到长时间吸入高浓度氧是导致ROP发生的重要原因，那么合理的氧疗是减少ROP发生的一重要的措施。高压氧作为治疗缺血缺氧性疾病的一种有效治疗方法已广泛地应用于临床，在治疗新生儿缺血缺氧性脑病所致的脑水肿中取得了较好的疗效。但高压氧是否可以应用于早产儿的治疗，一直是一个很有争议的问题，临床医生往往将高压氧与常压高浓度氧等同对待，甚

至过分地夸大高压氧的毒副作用，如此束缚了高压氧的发展，同样也束缚了对早产儿及新生儿缺血缺氧性疾病治疗的发展。到目前为止，临床上并无因高压氧治疗而导致ROP发生的病例报道，当然这可能与高压氧在早产儿中的应用非常有限有关。肖小敏^[45]等对28例32周后的胎儿宫内发育迟缓患者给予常规治疗剂量的HBO治疗未发现未成熟儿视网膜病变的发生。谢金祥